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本试剂盒基于单引物非序列依赖扩增（SISPA）与SYBR Green实时荧光检测技术，可对纯化的DNA、RNA样本进行无偏好、全覆盖全基因组/全转录组扩增。采用带标签随机简并单引物，先完成反转录与二链合成，再通过单一通用引物实现全序列扩增；实时荧光动态监测扩增进程，无需文库构建即可获得足量纯净扩增产物，完美适配NGS建库、芯片、分型等下游应用。

• 单引物极简操作：无需设计特异性引物对，单条简并引物即可完成全基因组扩增。
  
• 全覆盖无偏好：随机引物结合基因组所有区域，无序列偏好，扩增均匀性高，等位基因缺失率低。。
  
• 通用纯化模板兼容：对纯化后的DNA/RNA模板无严格浓度要求，仅需加入4μL核酸样本即可启动扩增，适配不同起始量的纯化核酸，使用更灵活。
  
• 实时可视监测：荧光染料实时追踪扩增过程，自动生成扩增曲线与熔解曲线，快速判定扩增特异性。
  
• 快速高效：全程约3小时完成扩增，实验周期短，结果稳定可重复。
  
• 高特异性：搭配热启动酶体系，减少非特异性扩增，熔解曲线单峰验证产物纯度，有效降低引物二聚体干扰。

1. 如果有N个样本，则标记N+1个0.2mL的PCR管，取4μL提取纯化好的RNA样本分别加入样品管，按如下体系进行第一链合成。
   

   成分	样品管N个	NTC对照管
   RNase抑制剂	各1μL	1μL
   dNTP(各10mM)	各1μL	1μL
   带标签通用引物(20μM)	各1μL	1μL
   RNase-free水	各7μL	11μL
   纯化的RNA样本	各4μL	不加
   混匀后，65℃ 5分钟，4℃ hold。
   5×第一链合成缓冲液	各4μL	4μL
   DTT溶液(100mM)	各1μL	1μL
   反转录酶(200U/μL)	各1μL	1μL
   25℃ 20分钟，50℃ 60分钟，70℃ 15分钟，4℃ hold。

   
   
2. 取上一步产物，加入如下体系进行第二链合成。
   

   成分	样品管N个	NTC对照管
   上一步产物	各20μL	20μL
   Klenow酶(1U/μL)	各1.5μL	1.5μL
   95℃ 5分钟，37℃ 1小时，75℃ 10分钟，4℃ hold。

   
   
3. 进行EXO-SAP纯化（去除引物），加入如下体系进行。
   

   成分	样品管N个	NTC对照管
   上一步产物	各21.5μL	21.5μL
   RNase-free水	各15.5μL	15.5μL
   10×SAP缓冲液	各1μL	1μL
   虾碱性磷酸酶(1U/μL)	各1μL	1μL
   核酸外切酶I(5U/μL)	各1μL	1μL
   37℃ 1小时，75℃ 15分钟，4℃ hold

   
   
4. 取8μL上一步产物，加入如下体系进行单引物扩增。
   

   成分	样品管N个	NTC对照管
   超纯水	各23.5μL	23.5μL
   10×qPCR缓冲液	各5μL	5μL
   MgCl2溶液(25mM)	各6μL	6μL
   dNTP(各10mM)	各1.5μL	1.5μL
   通用引物(20μM)	各3μL	3μL
   20×饱和染料	各2.5μL	2.5μL
   DNA聚合酶(5U/μL)	各0.5μL	0.5μL
   上一步产物	各8μL	8μL

   
   
5. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR。
   

   过程	温度	时间
   预变性	95℃	5min
   PCR反应 (40个循环)	95℃	30sec
   	55℃	30sec
   	65℃	90sec（采集SYBR通道的荧光信号）
   溶解曲线分析		按qPCR仪器手册执行

6. 如果有N个样本，则标记N+1个0.2mL的PCR管，取4μL提取纯化好的DNA样本分别加入样品管，按如下体系进行。
   

   成分	样品管N个	NTC对照管
   5×第一链合成缓冲液	各2μL	2μL
   dNTP(各10mM)	各1μL	1μL
   带标签通用引物(20μM)	各1μL	1μL
   RNase-free水	各10.5μL	14.5μL
   纯化的DNA样本	各4μL	不加
   混匀后，95℃ 5分钟，4℃ hold。
   Klenow酶(1U/μL)	各1.5μL	1.5μL
   37℃ 1小时，75℃ 10分钟，4℃ hold。

   
   
7. 后续实验同步骤2～5。
   
8. 实验结果：有扩增的样本将有平缓的S荧光曲线，无模板对照将没有此标准扩增曲线（见下图）或扩增曲线：
   
   
   
   
9. 扩增所得DNA可以用于后续实验。